Окончил Петербургское коммерческое училище. Служил в Киевской конторе Госбанка, одновременно играл на сцене в труппе П.П.Струйского. На профессиональной сцене — с 1920 года. Работал в театрах Киева, Старого Оскола, Кременчуга.
С 1925 по 1927 гг. – в Ленинградском театре «Комедия», затем в театрах Дальнего Востока, Ярославля и др. С 1934 по 1945 гг. – актер и режиссер Одесского драматического театра, роли: Несчастливцев, Городничий; Антипа Зыков («Зыковы»), Окаёмов («Машенька» Афиногенова).
С 1946 года – в Малом театре: «Горе от ума» (Фамусов, 1947), «Доходное место» (Вышневский, 1948), «Минувшие годы» (Трабский, 1948), «Заговор обреченных» (Пино, 1949), «Живой труп» (Абрезков, 1951) и другие.
В кинематографе Комиссаров дебютировал ещё в 1927 году — в немом фильме «Кастусь Калиновский». Работы в кино: «Кармелюк» (1938), «Моряки» (1939), «Щорс» (1939), «Дочь моряка» (1941), «Лермонтов» (1943), «Сталинградская битва» (1949), «Секретная миссия» (1950), «Кавалер Золотой звезды» (1950), «Убийство на улице Данте» (1956), «Поединок» (1957) и другие. Дважды был Лауреатом Сталинской премии.
Записи на радио – «Рюи Блаз» В.Гюго (Дон Саллюстий, 1949), «Девятый вал» И.Эренбурга (Дюма, 1953), «Коварство и любовь» (Президент, 1955), «Живой труп» (князь Абрезков, 1952), «Барышня-крестьянка» (Муромский, 1955), «Лето младшего брата» (Мартын Пудан, 1956).
Николай Валерьянович Комиссаров ушел из жизни - 30 сентября 1957 года. Похоронен на Введенском кладбище в Москве.