Актерской профессией он занялся совершенно случайно. Однажды шутки ради снялся в рекламе, и парень, заведовавший съемками, отметил, что у Марка есть актерский потенциал. Пеллегрино обзавелся агентом и стал ходить на прослушивания, не зная толком, что там надо делать. Его агент, видя, что клиенту нужно подучиться, снабдил его списком актерских школ, и Марк выбрал одну, обучение в которой стоило не слишком дорого, а школа находилась неподалеку от его дома. Оказалось, что он попал в одну из лучших актерских школ Западного побережья.
Пеллегрино снимается в кино с середины 80-х, и вот, наконец, добился такой популярности, что когда люди встречают его на улицах, они останавливаются и с криком «о, боже, это Джейкоб!» пытаются прикоснуться к актеру – видимо, в надежде на бессмертие, которое его персонаж дарил прикосновением ладоней.
В 1987 году он получил маленькую роль в одном из эпизодов сериала «Законы Лос-Анджелеса» и сыграл Франкенштейна в криминальной комедии «Роковая красотка».
В начале 90-х, пока Марк ходил с одного прослушивание на другое, он какое-то время работал страховым агентом и собирал деньги на благотворительные нужды для калифорнийского отделения NARAL, национальной ассоциации, которая борется за отмену законов, запрещающих аборты. Ему довольно долго приходилось играть бессердечных подручных главного злодея – очень уж к этому располагала внешность Пеллегрино, высокого холодного блондина. Такую роль предложили ему и в культовой комедии братьев Коэнов «Большой Лебовски» – именно Пеллегрино досталась честь макать персонажа Джеффа Бриджесса головой в унитаз.
Одна из самых выигрышных его ролей – это роль буйного бывшего мужа Риты, подружки Декстера, в сериале «Декстер». По сюжету, у персонажа Пеллегрино возникают проблемы с бывшей женой и ее нынешним ухажером, который по совместительству еще и маньяк, восстанавливающий попранную справедливость. Марк признался, что во время съемок он и исполнитель роли Декстера Майкл Холл избегали друг друга, подозревая взаимную неприязнь, и это придавало их персонажам дополнительную реалистичность. Однако уже после съемок они разговорились и расстались лучшими друзьями.
В качестве приглашенной звезды Пеллегрино снимался в сериалах «Северная сторона», «Скорая помощь», «Без следа» , «Секретные материалы», «Зверь» и «Рыцарь дорог». На большом экране Марк появился в фильмах «Все захваты разрешены», «Смертельное оружие 3», «Парк Юрского периода 2», «Малхолланд Драйв», «Загнанный», «Сокровище нации», «Капоте» и «Роковое число 23».
Когда ему было 20 с небольшим, Пеллегрино крестился в церкви, но сегодня религию ему заменяет духовно-философский подход к жизни. Кстати, он сыграл роль епископа в новом мистическом телесериале «Быть человеком», истории о привидении, вампире и оборотне, которые живут в одном доме и пытаются вести обычную человеческую жизнь.
В 2009 году он снялся в телесериале «Остаться в живых», где сыграл таинственного Джейкоба. Его роль в этом сериале хоть и была довольна небольшой, но в то же время очень значительной для мифологии сериала. Поэтому было очень важно, чтобы Джейкоб предстал перед зрителями именно в таком виде, в котором его задумали сценаристы. И Марку это удалось очень даже хорошо. Он так хорошо сыграл эту роль, что это не оставило равнодушными не только зрителей, но и руководителей других телепроектов. Благодаря этому успеху, его пригласили в другой американский телесериал «Сверхъестественное», где он сыграл Повелителя ада — Люцифера. Также Марк согласился сняться в финальном сезоне телесериала «Остаться в живых», где он вернулся к роли Джейкоба.
В 2011 году он начал сниматься в американской версии сериала «Быть Человеком», где так же сыграл довольно значительную роль главного вампира Бостона и отца одного из главных героев, а именно Эйдена, которого он превратил в вампира во времена Войны за независимость. В 2013 году получил главную роль руководителя тайной организации в телесериале «Люди будущего».
Личная жизнь
Марк женат на Трейси Азиз, которая тоже нашла себя в индустрии кино, но с другой стороны камеры – Трейси работает помощником режиссера. Он воспитывает падчерицу Тесс и вместе с семьей живет в Лос-Анджелесе. Пеллегрино живёт в Лос-Анджелесе.
Марк - фанат боевых искусств, занимается кикбоксингом, профессиональным тайским боксом, дзюдо, карате, тхэквондо и джиу-джитсу. Он очень любит чтение и совсем не смотрит телевизор. В юности Марк собирался стать морским биологом, потому что очень любил природу и океан. У него две таксы - Джонни и Фрэнки. Помимо съемок, Пеллегрино несколько лет преподает курс актерского мастерства в драматической школе театра Плейхауз-Уэст.
В юности Марк собирался стать морским биологом, потому что очень любил природу и океан. У него две таксы — Джонни и Фрэнки. Помимо съёмок, Пеллегрино несколько лет преподаёт курс актёрского мастерства в драматической школе театра «Playhouse West».