С 1940 года служил в армии (в общей сложности 6 лет), участвовал в Великой Отечественной войне.
В 1947 – 1948 гг. учился в студии при Куйбышевском драмтеатре имени М. Горького, по окончании которой играл на сцене этого театра вплоть до 1972 года.
С 1972 года – актёр МХАТа (после раскола театра в 1987 году остался в МХАТе имени Горького под руководством Т. Дорониной).
Манере Николая Засухина были присущи темперамент, мягкий юмор, стремление к внутреннему перевоплощению, пластичность и острый рисунок роли.
В кино Засухин снимался нечасто, играя преимущественно чиновников и партийных работников: заместитель председателя Совета министров СССР («Твой современник»), Ленин («Поезд в завтрашний день»), Смоленцев («Комитет 19-ти»), Власин («Свеаборг»), Никодимов («Свой среди чужих, чужой среди своих»), Железненький («Развлечение для старичков»), Ковалёв («Легко быть добрым»). В ряде фильмов сыграл Вячеслава Молотова.
Цитата из книги В. Смехова "Записки на кулисах":
"Меня влечёт "высокий штиль" речи, когда я говорю о замечательной работе Николая Николаевича Засухина . Но я не одинок: до сего дня (а прошло два десятилетия) живет эхо его игры в "Ричарде", очень многие люди и Москвы, и Куйбышева, и других городов с удовольствием делятся радостью старого воспоминания. Я даже не ссылаюсь на объемную прессу. Я помню толпы зрителей, взыскательных и весьма в то время утоленных москвичей, через полчаса неистовых оваций... Засухин , мне казалось, больше уставал от выходов на поклоны, чем от всего спектакля. А зритель хлопал в старом, добром здании МХАТа (там шли летом гастроли), и много раз повторялось: "Спасибо, Засухин ! Оставайся в Москве!..". Через много лет он "послушался" и остался. И работает, между прочим, артистом (народным артистом) в Художественном театре. Но это - совсем другая песня, другой разговор."
Ушёл из жизни 25 августа 1992 года. Похоронен на Ваганьковском кладбище в Москве (участок № 32).