Сергей Пуспекалис учился в Саратове, в Саратовском театральном училище, затем прошёл срочную службу на военно-морском флоте, работал актёром в Саратовском ТЮЗе, учился у Петра Фоменко в РАТИ, выпустился в 2001 году.
После выпуска из РАТИ поставил в Москве пьесу «Двадцать семь» А. Слаповского и этот спектакль участвовал в одном из фестивалей «Балтийский дом». Затем поставил спектакль по пьесам А. Слаповского «От красной крысы до зелёной звезды» в омском «Пятом театре». С. Пускепалис и А. Слаповский — постоянные соавторы, Сергей Пускепалис неоднократно ставил спектакли по его пьесам.
Работал режиссёром в Самарском театре «Понедельник».
С мая 2003 года по 2007 год Сергей Пускепалис — главный режиссёр Магнитогорского театра драмы им. А. С. Пушкина. С июня 2009 года — главный режиссёр Российского государственного академического театра драмы имени Фёдора Волкова (Ярославль). Для постановок спектаклей приглашается самыми известными драматическими театрами России. Семья Сергея Пускепалиса живёт в Железноводске.
В кино снимается с 2003 года. Первая роль была эпизодическая. С кинорежиссёром Алексеем Попогребским познакомился на съёмках фильма «Коктебель» в котором снимался сын Сергея Пускепалиса — Глеб. Позднее Попогребский пригласил Сергея на главные роли в фильмах «Простые вещи» и «Как я провёл этим летом».
В Магнитогорске вёл курс на театральном факультете Магнитогорской консерватории.